پایان نامه کارشناسی ارشد اصلاح نباتات

پایان نامه کارشناسی ارشد اصلاح نباتات

اصلاح نباتات

فهرست مطالب

فصل اول: مقدمه

مقدمه ------------------------------------------------------------ 2

فصل دوم: بررسی منابع

10 کلزا

2-1- خصوصیات کلی وعمومی کلزا--------------------------------------- 10

2-1-1- تاریخچه ومبدا ژنتیکی گیاه کلزا------------------------------------ 10

2-1-2- خصوصیات گیاه شناسی کلزا------------------------------------- 10

2-1-3- کشت و تولید کلزا-------------------------------------------- 11

2-1-4- برداشت کلزا------------------------------------------------ 13

2-1-5- ارقام وگونه های کلزا------------------------------------------ 14

2-1-6- مهمترین گونه های جنس براسیکا---------------------------------- 16

2-1-7- اهمیت اقتصادی وصنغتی کلزا------------------------------------- 17

2-2- اصلاح گیاه کلزا------------------------------------------------ 18

2-2-1- روشهای اصلاح کلزا------------------------------------------- 18

2-2-2- اهداف اصلاحی کلزا------------------------------------------- 19

2-3- گیاهان هاپلوئید------------------------------------------------- 20

2-3-1- مزایا و کاربردهای هاپلوئیدها-------------------------------------- 21

2-3-2- مشکلات ومحدودیت های هاپلوئیدها-------------------------------- 22

2-3-3- روشهای تولید گیاهان هاپلوئید------------------------------------- 23

2-3-3-1- تولید خود به خودی (روشهای طبیعی)----------------------------- 23

2-3-3-2- تولید القایی(روشهای آزمایشگاهی)------------------------------- 24

2-3-3-2-1- آندروژنز(نرزایی)----------------------------------------- 24

2-3-3-2-1-1- کشت بساک------------------------------------------- 25

2-3-3-2-1-2- کشت میکروسپور--------------------------------------- 25

2-3-3-2-2- ژینوژنز(کشت تخمدان وتخمک)------------------------------- 26

2-3-3-2-3- روش حذف کروموزومی------------------------------------- 27

2-4- کشت میکروسپورهای جدا گردیده کلزا--------------------------------- 28

2-5- عوامل موثر بر رویانزایی میکروسپورهای جدا گردیده کلزا--------------------- 29

2-5-1- شرایط رشد، فیزیولوژی و ژنوتیپ گیاه مادری--------------------------- 29

2-5-2- اندازه غنچه-------------------------------------------------- 32

2-5-3- مراحل تکاملی میکروسپورها--------------------------------------- 33

2-5-4- تراکم میکروسپور در محیط کشت----------------------------------- 35

2-5-5- ترکیب محیط کشت-------------------------------------------- 36

2-5-6- دما------------------------------------------------------- 40

2-6- مکانیسم رویانزایی----------------------------------------------- 43

2-6-1- مقدمه----------------------------------------------------- 43

2- 6-2- تقسیم قرینه هسته والقائ رویانزایی--------------------------------- 45

2-6-3- حوادث چرخه سلولی در طی رویانزایی میکروسپورها--------------------- 47

2-6-4- خانواده های ژنی درگیر با رویانزایی میکروسپورها در کلزا----------------- 47

2-7- عوامل موثر بر باززایی گیاه از رویانهای هاپلوئیدی کلزا---------------------- 48

2-7-1- بلوغ ،مرحله رشد ونمو رویانها------------------------------------ 48

2-7-2- اندازه رویانها--------------------------------------- --------- 49

2-7-3- محیط کشت------------------------------------------------ 50

2-7-5- BAP وژیبرلیک اسید------------------------------------------- 50

2-7-6- استفاده از کاغذ فیلتر در محیط کشت یا زراعی------------------------- 51

2-7-7- زغال فعال-------------------------------------------------- 51

2 -7-8- تیمار ABA و ابگیری رویانها------------------------------------- 51

2-8- موارد استفاده از کشت میکروسپورکلزا-------------------------------- 56

2-8-1- اصلاح نباتات و مهندسی ژنتیک----------------------------------- 56

2-8-2- موتا سیون و انتخاب ------------------------------------------ 56

2-8-3- کشت میکروسپوروتکنولوژی بذر مصنوعی--------------------------- 57

2-8-4- سیستم کشت میکروسپور در مطالعات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی------------- 57

2-8-5- استفاده در کشت و امتزاج پروتوپلاستها----------------------------- 57

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- مواد گیاهی-------------------------------------------------- 60

3-2- کشت بذور-------------------------------------------------- 60

3-3- شرایط اتاق رشد---------------------------------------------- 60

3-4- مراقبت های زراعی-------------------------------------------- 61

3-5- برداشت غنچه ها وتعیین مرحله مناسب میکروسپورها جهت جنین زایی--------- 61

3-6- محیط های کشت، ایزولاسیون وباززاییدر کشت میکروسپورهای کلزا----------- 62

3-6-1- محیط ایزولاسیون میکروسپورها---------------------------------- 62

3-6-2- محیط کشت میکروسپورها------------------------------------- 62

3-6-3-1- استریل کردن محیط کشت میکروسپورهای کلزا--------------------- 62

3-6-4- محیط کشت باززایی ، جنین های حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا------- 63

3-6-5- وسایل مورد نیاز جهت کشت میکروسپورهای کلزا--------------------- 68

3-7- روش انجام آزمایش کشت میکروسپورهای کلزا------------------------- 69

3-7-1- برداشت غنچه ها-------------------------------------------- 69

3-7-2- استریل کردن غنچه ها----------------------------------------- 69

3-7-3- استخراج میکروسپورها----------------------------------------- 69

3-7-4- تعیین تراکم میکروسپورها--------------------------------------- 70

3-8- آزمایشات انجام شده-------------------------------------------- 71

3-8-1-مطالعه اثرتراکمهای مختلف میکروسپوربرروی جنین زایی میکروسپورهای کلزا---- 71

3-8-2- مطالعه باززایی گیاه در جنین هایی با اندازه های مختلف حاصل از کشت

میکروسپورهای کلزا------------------------------------------------- 72

3-8-3- مطالعه اثراستفاده از کاغذ صافی یا کاغذ فیلتردر میزان ریشه زایی ،ارتفاع گیاهچه ها

ودرصد گیاهچه های نرمال--------------------------------------------- 73

3-8-4- مطالعه اثر استفاده ازشوک سرمایی بر روی درصد تشکیل گیاهچه های طبیعی-- 74

3-8-5- تعین سطح پلوئیدی گیاهچه های باززایی شده-------------------------- 75

3-9- تجزیه و تحلیل داده ها-------------------------------------------- 78

فصل چهارم:نتایج وبحث

4-1- جنین زایی میکروسپورهای کلزا در تراکمهای مختلف میکروسپور در محیط کشت---- 82

4-2- اثراندازه های مختلف جنین برروی صفات باززایی جنین های حاصل ازکشت

میکروسپورهای کلزا-------------------------------------------------- 84

4-3- اثراستفاده ازکاغذ صافی یا کاغذ فیلتردر میزان ریشه زایی ،ارتفاع گیاهچه ها

ودرصد گیاهچه های نرمال--------------------------------------------- 90

4-4- اثر استفاده ازشوک سرمایی بر روی درصد تشکیل گیاهچه های طبیعی---------- 97

4-5- پیشنهادات--------------------------------------------------- 105

منابع مورد استفاده-------------------------------------------------- 107

• 
  

  فصل اول: مقدمه

  
  


• مقدمه :

گياه كلزا مهمترين گونه زراعي جنس براسيكا (Brassica) ميباشد. و ويژگيهاي خاص اين گياه يعني قابليت كشت در نقاط مختلف ، در صد بالاي روغن آن ، كيفيت مطلوب روغن ، كاربرد روغن آن در صنايع نساجي و پلاستيك و نيز استفاده از كنجاله آن در تغذيه دام سبب شده است كه توسعه كشت اين گياه بعنوان نقطه اميدي جهت تامين روغن خام مورد نياز كشور و رهائي از وابستگي بشمار رود .بطوريكه در حال حاضر كلزا نقطه ثقل طرحهاي افزايش توليد دانه هاي روغني محسوب ميگردد. دانههاي روغني قسمت مهمي از توليد محصولات كشاورزي را شامل ميشوند، چون علاوه بر مصارف صنعتي از لحاظ تغذيه نيز اهميت بسزايي دارند. سطح زير کشت دانههاي روغني در سال 1383 (بجز کنجد که در سيستم روغن کشي وارد نميشود) 319 هزار هکتار و محصول توليد شده (دانه) حدود 400 هزار تن بوده است. مصرف روغن نباتي در سال 1383 بالغ بر 1180 هزار تن بودهاست که 170 هزار تن از آن معادل حدود 4/14 درصد، از توليد داخل تامين شده است ( بي نام ، 1382 ). كلزا به عنوان يك گياه روغني با بيش از 40% روغن در دانه از گياهان مهم جهت توسعه كشت نباتات روغني وتوليد روغن نباتي در ايران است. كلزا با نام علمي Brassica napus و نام انگليسي Rapeseed گياهي از تيره Brassicacea ( چليپائيان يا شب بو ) ميباشد كه پس از سويا و نخل روغني مقام سوم را در تأمين روغن نباتي جهان به خود اختصاص داده است كه در حدود 7/14% كل توليد روغن نباتي جهان را تأمين ميكند. اين گياه در برابر خشكي و سرما مقاوم بوده و به دليل سازگاري، دامنه كشت وسيعي دارد ( دهشيري 1378 ). روشهاي سنتي (كلاسيك) اصلاح نباتات از دير باز براي توليد گياهان زراعي برتر مورد استفاده قرار ميگرفته است كه مبتني بر ايجاد تغيير در ساختار ژنتيكي گياه كامل در جهت هدف خاصي با استفاده از تلاقيهاي بین جنسي ودرون جنسی بوده است.

روشهاییكه جهت اصلاح گياهان خود گشن بكار گرفته ميشوند٬ عمدتا روشهاي گزينش (Selection) و يا دورگ گيري (Hybridization) است كه در مورد اول از تنوع ژنتيكي موجود در توده هاي طبيعي و بومي استفاده شده و واريته هاي اصلاح شده اي كه نسبت به جامعه اوليه برتري هائي از نظر كمي و كيفي دارند بوجود مي آیند. شانس موفقيت در اين روش نسبتا كم است زيرا به غناي ژنتيكي توده هاي محلي بستگي دارد كه امروزه رو به كاهش بوده و كمتر قابل دسترسي است. در مقابل روشهاي مبتني بر تلاقي به اصلاحگر اين امكان را ميدهد كه بطور هدفدار صفات مطلوب واريته هاي مختلف را با يكديگر تلفيق نمايد(Poehlman and Mitton , 2003).

يك پروژه اصلاح نباتات از زمان انجام دورگ گيري تا آماده شدن واريته جهت كشت ، حدودا 10 تا 15 سال زمان صرف می شود لذا امروزه متخصصين اصلاح نباتات به دنبال روشهائي هستند كه بتوان اين مدت زمان را به حداقل ممكن رسانيد تا در وقت و هزينه هاي سنگين برنامه هاي اصلاح نباتات صرفه جوئي شود. براي اين كار سعي بر اينست كه بتوان با ايجاد تغیيرات ژنتيكي در سطح سلول ، زمان لازم براي تهيه ارقام پر محصول با كيفيت بالا و مقاوم به بيماري و يا تنشهاي محيطي را در برنامه هاي به نژادي كوتاه كرد(اصلاني و همكاران ، 1381).

كلزا گياهي خودگشن- دگرگشن ميباشد ودرصد دگرگشني آن در ارقام مختلف بين 33%-22% گزارش شده است ( شهيدي و فروزان ، 1376 ). اين گياه آلوتتراپلوييد (38=x4=n 2) ميباشد.روشهاي سنتي اصلاح نباتات در چند دهة اخير نقش بسيار مهمي در اصلاح عملكرد و كيفيت كلزا داشته اند كه از ميان اين روشها مي توان به روش انتخاب توده اي[1] و گزينش شجره اي[2] اشاره كرد. از معايب اين روشها طولاني بودن دورة آنها مي باشد. امروزه متخصصين اصلاح نباتات به دنبال روشهاي ديگري هستند كه بتوانند اين مدت را به حداقل ممكن برسانند تا در وقت و هزينه هاي سنگين برنامه هاي اصلاح نباتات صرفه جويي شود. يكي از اين روشها اصلاح از طريق سيستم دابل هاپلوئيدي[3] مي باشد، كه به عنوان وسيله اي براي تركيب صفات يك تلاقي مي تواند مكمل روش شجره اي باشد. اهميت استفاده از گياهان هاپلوئيد در برنامه هاي اصلاح نباتات از مدتها پيش براي دانشمندان مسلم گرديده است و يكي از موضوعات مهم تحقيقاتي در اين زمينه، توليد لاينهاي هموزيگوس جهت توليد گياهان هيبريد در گونه هاي خودناسازگار مي باشد. با توليد لاينهاي كاملاً هموزيگوت در اين روش 5-3 سال در زمان برنامه هاي اصلاحي صرفه جويي مي شود. سيستم دابل هاپلوئيدي در صورتي موفق است که به توان گياهان هاپلوئيد ودابل هاپلوئيد توليد کرد، بدين منظور قبل از استفاده از اين سيستم آزمايشاتي را در جهت بهينه سازي گياهان مي بايست انجام داد. روشهاي متعددي جهت توليد گياهان هاپلوئيد و به دنبال آن گياهان دابل هاپلوئيد وجود دارد كه يكي از اين روشها آندروژنز[4] مي باشد.

آندروژنز به دو روش انجام مي شود : الف ـ كشت بساك[5] ب ـ كشت ميكروسپور[6] . كشت ميكروسپور اخيراً به لحاظ مزاياي آن بر كشت بساك، مورد توجه قرار گرفته است. در اين روش امكان توليد تعداد زيادي گياهان هاپلوئيد وجود دارد. توليد سريع لاينهاي خالص از ميكروسپورهاي جدا شده، مهمترين ويژگي اين روش در برنامههاي اصلاحي مي باشد. همچنين با توجه به فراواني بالاي توليد گياه از كشت ميكروسپور و نيز سهولت انتقال ژن ، كشت ميكروسپور ، كارآمدترين و بهترين اندام هدف در انتقال ژن به شمار مي آيد و دانشمندان اميدوارند كه در آينده اي نزديك از اين روش به عنوان يك روش متدوال در مهندسي ژنتيك استفاده نمايند. ميكروسپورهاي گياهان F₁ مي توانند لاينهاي دابل هاپلوئيد بسياري توليد كنند تا براي تركيب مطلوبي از صفات گزينش شوند. لاينهاي انتخابي، كاملاً خالص هستند و از نظر يكنواختي و پايداري براي به نژادگران مشكلات كمتري به دنبال دارند .(Mohan Jain et al., 1996) توليد رويانهاي هاپلوئيد و به دنبال آن توليد گياهان دي هاپلوئيد در كلزا از اهميت ويژه اي برخوردار مي باشد . در طبيعت توليد گياهان هاپلوئيد به صورت خودبهخودي، درگونه هاي Brassica در فراواني بسيار پايين (حدود 4/19-05/0 در هزار گياه ) اتفاق ميافتد ( Banga and Labana , 2003 ) . اما به هر جهت بهره وري واقعي از هاپلوئيدهاي ردهBrassica با كشف روشهاي القاء رويان از بساكها و ميكروسپورهاي جدا شده در شرايط درون شيشه اي آغاز گرديد . گياهان هاپلوئيد زيادي بطور رايج توسط كشت بساك يا ميكروسپورهاي جدا شده توليد مي شوند، اگرچه تنوع قابل ملاحظه اي بين گونهها ، واريتهها و ارقام مختلف وجود دارد ، اما تكنيكهاي كشت ميكروسپور جدا شده و كشت بساك به طور موفقيتآميزي براي اكثرگونهها و واريتههاي تجاري رده Brassica استفاده شده است و در سالهاي اخير پيشرفتهاي چشمگيري در اين زمينه بدست آمده است ، به طوريكه رويان زايي ميكروسپور در B. napus يكي از كاملترين سيستمها براي توليد گياه در شرايط درون شيشه اي[7] است((Burnett et al., 1992 .

تكنيك باززايي گياه از رويانهاي حاصل از كشت ميكروسپور براي اصلاح نباتات و مهندسي ژنتيك ضروري است اما گزارش شده است كه اكثر رويانها به گياهچه تبديل نميشوند و به صورت غير طبيعي باززايي ميشوند يا اينكه رويانهاي ثانوي را تشكيل ميدهند. ( Takahata,1997 ) همچنين عدم باززايي يا باززايي بسيار اندك رويانهاي هاپلوئيد به خصوص در كشت پرچم نيز گزارش گرديده است ( Bruins and Snijder, 1995 ) . در ايران ، براي اولين مرتبه آزمايشاتي در زمينه رويان زايي و باززايي در قالب پاياننامه كارشناسيارشد در دانشكده كشاورزي دانشگاه تربيت مدرس انجام شد كه موفقيت چشمگيري نيز حاصل شد. در اولين تحقيق ( باقري ، 1379 )، سه رقم بهاره ( F704, Global, Maluka ) وسه رقم پاييزه كلزا (Ceres Slmo46, Bounty, ) از لحاظ پاسخ به كشت ميكروسپور مورد ارزيابي قرار گرفتند كه در دو آزمايش هيچ روياني بدست نيامد، اما در آزمايش آخر، از 36 پتريديش كشت شده حدود 20 رويان حاصل شد و رقم Bounty در رويان زايي و باززايي گياه، به عنوان بهترين ژنوتيپ شناخته شد. در تحقيق ديگر ( خنجي ، 1380 )، پاسخ به كشت ميكروسپورهاي جدا شده كلزا در يك رقم بهاره ( Global ) و دو رقم پاييزه ( Okapi و Colvert ) مورد بررسي قرار گرفت. رقم Global به عنوان بهترين رقم در بين ارقام استفاده شده از نظر پاسخ دهي به كشت ميكروسپور كلزا شناخته شد و در هر پتريديش كشت شده، حدود 22% رويان بدست آمد. در تحقيق ديگر ( عبدالهي ، 1381 )، اثر تراکم، اثر شوک حرارتي و اثر تعويض محيط کشت بر روي رويان زايي، واثر اندازه هاي مختلف رويان بر روي باززايي گياه در رقم بهاره کلزا ( Global ) مطالعه شد. در اين تحقيق، بالاترين ميزان رويان زايي در تراکم 40000 ميكروسپور در هر ميليليتر محيط كشت بدست آمد. تعويض محيط كشت، ميزان رويان زايي ميكروسپورهای کلزا را در تراكم هاي مختلف ميكروسپور افزايش داد و رويانهاي5 ميليمتري، بهترين باززايي را نشان دادند. در تحقيق ديگر ( حبيبي ، 1382 )، اثر حجمهاي مختلف محيط کشت بر روي رويان زايي و اثر شوک حرارتي و زغال فعال بر روي باززايي گياه رقم بهاره کلزا ( PF ) مطالعه شد. در اين تحقيق، بالاترين ميزان رويان زايي در پتريديشهايي با قطر cm 10 و حجمهاي محيط كشت ml 5/12 و ml 10 بدست آمد. همچنين مقايسه ميانگين اثر غلظتهاي مختلف زغال فعال در محيط کشت باززايي بر روي درصد تشكيل گياهچههاي طبيعي نشان داد، كه غلظتهاي مختلف زغال فعال در سطح 5% با هم اختلاف معنيداري را نشان ميدهند، بطوريكه ميزان l^-1 g 125/0 زغال فعال با توليد 40% گياهچه كاملاً طبيعي، در گروه a قرار گرفت .

در اين تحقيق سعي بر اين است تا شرايط براي باززايي گياهان حاصل از رويانهاي بدست آمده از ميكروسپورها بهينه سازي شود، براي اين منظور اثرات مختلف شوكهاي سرمائي و نيز آبگيري رويانها و اثر استفاده از كاغذ صافي مورد آزمايش و مطالعه قرار گرفت ، تيمار آبگيري رويانها با تسريع در بلوغ رويانها ( Wang et al., 2002 ) ، درصد باززايي گياهان را افزايش مي دهند. در ارتباط با مطالعه اثرشوكهاي سرمائي، سرماي هوا نيز مي تواند بر روي تبديل رويان به گياه موثر باشد.

در هنگام انجام این تحقیق سوالهائی از قبیل سوالات ذیل مطرح بودندکه پاسخ به آنها به تفصیل در قسمت مربوطه آورده شده است

1- آيا اعمال شوكهاي سرمائي ميتواند اثر معني داري بردرصد باززايي گياهان کلزاي مورد مطالعه داشته باشد ؟

2- آيا استفاده از كاغذ صافي ميتواند اثر معني داري روي درصد باززايي گياهان کلزاي مورد مطالعه داشته باشد؟

3- آيا اثر تراكمهاي مختلف ميكروسپورها بر روي جنين زائي ميكروسپورهاي كلزا اثر معني داري دارد؟

4- آيا باززائي گياه سبز در جنين هائي با اندازه هاي مختلف حاصل از كشت ميكروسپورهاي كلزا با هم تفاوت معني داري دارند؟

فصل دوم: بررسی منابع

کلزا:

2-1 : خصوصيات کلي و عمومي کلزا :

2-1-1 : تاريخچه و مبدأ ژنتيكي گياه كلزا :

طبق نظر محققين خاستگاه گياه كلزا نواحي آسيا و اروپا ميباشد . زيرا زيرگونههاي متعلق به شلغم روغني به صورت وحشي از اروپاي غربي تا چين پراكنده شده اند ، پس ميتوان نتيجه گرفت كه اين گياه داراي دو موطن يكي در ناحيه افغانستان و پاكستان و ديگري در ناحيه مديترانه ميباشد (دهشيري ، 1378 ). اعتقاد بر اين است که B. napus بايد از جنوب اروپا منشا گرفته و در اوايل قرن 18 از آنجا به آسيا وارد شده باشد

( Downey and Robbelem , 1989) .

زراعت کلزا از 3000 سال قبل در هندوستان رواج داشته و از آنجا به چين و ژاپن راه يافته است. در اروپا استخراج روغن از دانه کلزا و دانه ساير گونه هاي متعلق به جنس Brassica دست کم از قرن 16 رواج داشته است، اين روغن ابتدا به عنوان روغن چراغ استفاده ميشد و سپس به عنوان روغن خوراکي مرسوم گرديد. توليد تجاري کلزا در سال 1942 به عنوان منبع تامين کننده روغن روان ساز در جنگ جهاني دوم آغاز گرديد ، اما به دليل قحطي و گرسنگي و کمبود منابع روغن خوراکي مقداري از آن به مصرف غذايي رسيد و پس از آن با توجه به امکان استفاده خوراکي ازاين روغن ، اصلاح آن موردتوجه قرار گرفت(عزيزي و همکاران ، 1378 ) .

2-1-2 : خصوصيات گياه شناسی كلزا :

كلزا[1] با نام انگليسي(n 2=x 4 = 38 ( Rapeseed گياهي از خانواده Cruciferae يا Brassicaceae (چليپائيان يا شب بو) با نام علمي Brassica napus L. ميباشد.

از نظر گياهشناسي، کلزا گياهي علفي با دوره رشد يکساله ميباشد و داراي ريشه اصلي و بلندي است که در شرايط مناسب تا عمق 80 سانتي متري خاک و حتي بيشتر نيز نفوذ مي کند. کلزا داراي يک ساقه اصلي و تقريبا مدور مي باشد که پس از به گل نشستن ساقه اصلي رشد ساقه فرعي آغاز مي شود و تعداد زيادي شاخه فرعي از آن منشعب مي شود. گل آذين به شکل خوشة بلندي است که در آن گلها از قسمت پائين خوشه شروع به شکفتن مي کنند. کلزا گياهي خودگشن است که ميزان خودگشني آن بيش از 70 % مي باشد. ميوه کلزا غلاف يا خورجيني به طول 5 تا 10 سانتي متر مي باشد که فاقد کرک است. كلزا يك گياه سرما دوست و روز بلند است و بهترين رشدآن درهواي خنك و دماي20-15درجه سانتيگرادمي باشد(عزيزي و همکاران ، 1378 ).

2-1-3 : کشت و توليد کلزا :

فعاليت در زمينه كشت و زرع كلزا در ايران اولين بار توسط شركت توسعه دانههاي روغني آغاز شده بطوريكه فعاليتهاي ترويجي ابتدا روی رقم سوئدي اورو ( Oro ) كه كلزايي از گروه يك صفر و جزء ارقام بهاره بود ، انجام شد ولي به دليل عدم موفقيت و بالابودن استاندارد روغن ، گسترش اين رقم محدود گرديد ( شهيدي، و فروزان ، 1376 ).

مهمترين كشورهاي توليد كننده كلزا را چين ، كانادا ، هند و سپس كشورهاي اروپايي تشكيل ميدهند . اين گياه رابطه نزديكي با ساير نباتات اين خانواده از جمله شلغم ، كلم ، كلم بروكلي و خردل دارد .

سطح زير کشت دانههاي روغني در سال 1383 ( بجز کنجد که در سيستم روغن کشي وارد نميشود ) 319 هزار هکتار و محصول توليد شده ( دانه ) حدود 400 هزار تن بوده است . مصرف روغن نباتي در سال 1381 بالغ بر 1180 هزار تن بودهاست که 170 هزار تن از آن معادل حدود 4/14 درصد ، از توليد داخل تامين شده است.

در سال زراعي 84 – 83 متوسط عملكرد زراعت كلزا نسبت به 3 سال گذشته 5 برابر افزايش يافته است و عملكرد زراعت كلزا در اين سال ( 84 – 83 ) نسبت به سال اول شروع طرح (79 -78 ) حدود 5/6 برابر افزايش يافته است که نتيجه اي بسيار مطلوب است. بالا ترين ركورد عملكرد زراعت كلزا در سال 79 – 78 با بازده بالا3700 كيلوگرم بوده است، در حاليکه در سال جاري در حدود 7296 كيلوگرم بود و بطور کلي توليد كلزا در سال زراعي84 – 83 با 63درصد افزايش نسبت به سال 81-82 به ۱۱۲ هزار تن رسيده است. سطح برداشت كلزا در سال جاري 83 –84 با 57/5درصد افزايش نسبت به سال82-83 به71400 هكتار رسيد و اين در حالي است كه سطح برداشت در سال زراعي 82-81 حدود 48400هكتار بود ( بي نام، 1382 ) . در سال زراعي84 – 83 ، 24000 هکتار از اراضي استان مازندران به کشت کلزا اختصاص يافته بود که جمعا 37000 تن محصول نيز از اين سطح برداشت شد . همچنين 2500 هکتار از اراضي شهرستان ايلام ،1500 هکتار از اراضي شهرستان آبدانان ( در 180 کيلومتری مرکز ايلام )، 490 هکتار از اراضي شهرستان زنجان ، 200 هکتار از اراضي شهرستان اردستان ( شمال اصفهان )، 156 هکتار از اراضي شهرستان رشت و30 هکتار از اراضي دشت پلنگ در شهرستان دشتي به کشت کلزا اختصاص يافته بود . در همدان ، قزوين ، کرمانشاه ، خرم آباد و چهار محال وبختياری کشت کلزا نيز صورت گرفت. قيمت پيشنهادى خريد دولت به مبلغ سه هزار و110 ريال با اختصاص 240 ريال يارانه به ازاي هر کيلوگرم کلزا، مي باشد (جدول 2 – 1). هزينه کاشت هر هکتار کلزا بين يک ميليون و پانصد هزار تا دو ميليون و پانصد هزار ريال می باشد که سود حاصله در هر هکتار کلزاکاری 3 ميليون تا 5 ميليون ريال است ( بي نام، 1382 ) .رشد سالانه توليد كلزا در دهه اخير ازسويا ، پنبهدانه ، آفتابگرادان و بادام زميني بيشتر بوده است. افزايش جمعيت دنيا و بهبود استانداردهاي زندگي موجب افزايش توليد كلزا براي مصارف روغن خوراكي خواهد شد.

جدول 2 – 1 : سطح زير کشت ، توليد ، عملکرد در هکتار و قيمت هر کيلوگرم دانههاي روغني در ايران در سال 84 - 1383 ( بي نام، 1382 )

2-1-4 : برداشت کلزا:

کلزا زماني آماده برداشت مي باشد که ساقه ها و غلاف ها زرد رنگ شده و دانه ها به رنگ تيره درآمده باشد و در صورت تکان خوردن ريزش کنند. دانه ها در اين مرحله بايستي حدود 15 % رطوبت داشته باشند، اين مدت برای کشت بهاره90-120روز وبرای کشت پاييزه180-240روز بعد از کشت است.کلزا سريع مي رسد بنابراين سريع مي بايست برداشت شود در غير اينصورت دانه ها ريزش مي کنند، به همين جهت در بعضي مناطق آنها را مانند کنجد قبل از زمان برداشت بريده و در محلي نگاهداری مي کنند تا رطوبت دانه ها کاهش يابد وسپس آنها را کمباين مي کنند.

2-1-5 : ارقام وگونه هاي کلزا :

از نظر طبقه بندي زراعي کلزا داراي دو تيپ بهاره و پاييزه ميباشد. از نظر پراکنش جغرافيايي کلزا عموماٌ در اروپا و کانادا کشت ميشود. ارقام بهاره و پاييزه کلزا به عنوان منبع روغن گياهي کشت ميشوند، ارقام پاييزه در شرايط مساعد پر محصول ميباشند. در اروپا و چين اغلب از ارقام پاييزه استفاده ميشود. در عرضهاي جغرافيايي و ارتفاعات بالاتر و در نقاطي که شانس بقاي گياه در زمستان کم است از ارقام بهاره استفاده ميشود ( عزيزي و همکاران، 1378 ) .

گياهان جنس Brassica بر حسب ميزان اروسيک اسيد به دو گروه عمده تقسيم ميشوند:

1- ارقامي که داراي مقادير زيادي اروسيک اسيد هستند ( در حدود 55 درصد يا بالاتر ) و باعلامت اختصاري [2]HEAR مشخص ميشوند و مصرف خوراکي ندارند.

2- ارقامي که کمتر از 5 درصد اروسيک اسيد در روغن آنها وجود دارد و در سال 1979 تحت عنوان [3] LEAR نامگذاري شده اند. رقم ارو[4] اولين رقم از اين دسته ميباشد و با انتقال ژنهاي توليدکننده اروسيک اسيد به درون ارقام سازگار ايجاد شده است (Downey et al., 1975 ). محققين کانادايي نام کانولا[5] را براي ارقام اصلاح شده کلزا ( داراي حداکثر 2 درصد اروسيک اسيد ) انتخاب نموده اند. علاوه بر اروسيک اسيد ، ماده مضر ديگري نيز به نام گلوکزينولات در کلزا وجود دارد باعث طعم تند و بو گزنده کنجاله آن ميشود و فيبر نيز از موادي است که باعث افت کيفيت کنجاله ميگردد.

تقسيم بندي کلزا بر اساس چگونگي اصلاح آن ، با توجه به 3 ماده اروسيک اسيد ، گلوکزينولات و فيبر ميباشد ( شهيدي و فروزان، 1376 ). يکي از بزرگترين موفقيتهايي که در اصلاح کلزا به وقوع پيوسته است تغيير محتوي اروسيک اسيد روغن از زياد به کم و همچنين کم کردن مقدار گلوکزينولات آن ميباشد.تقسيم بندي کلزا از نظر سه ماده فوق به قرار زير ميباشد ( شهيدي و فروزان، 1376 ) :

• کلزاهاي سنتي[6] : حاوي 60- 22 درصد اروسيک اسيد در روغن و 205 – 100 ميکرومول گلوکزينولات در هر گرم کنجاله هستند و جز ارقام HEAR محسوب مي شوند.


• ارقام يک صفر[7] ( 0 ) : در اين ارقام ميزان اروسيک اسيد به ميزان بسيار زيادي کاهش يافته است و به حدود 5 درصد رسيده است ولي ميزان گلوکزينولات آنها بالا ( 205 – 100 ميکرومول در هر گرم کنجاله ميباشد) ، كه هنوز هم توليد ميشود.


• ارقام دو صفر[8] ( 00 ) : در اين ارقام علاوه بر ميزان اروسيک اسيد که تا حدود 2 درصد کاهش پيدا کرده است ، ميزان گلوکزينولات نيز به 30- 18 ميکرومول در هر گرم کنجاله رسيده است . ارقام معروف به کانولا جز اين دسته محسوب ميشوند که داراي 2 درصد اروسيک اسيد و کمتر از 30 ميکرومول گلوکزينولات در هر گرم کنجاله ميباشند. رقم Tower اولين رقم كلزاي دوصفر توليد شده مي باشد ( دهشيري، 1378 ).


• ارقام سه صفر[9] ( 000 ) : اين ارقام حاوي حداقل ميزان اسيد اروسيك مي باشند و از نظر مقدار فيبر نيز اصلاح شده اند و اصطلاحاً به آنها کاندل (⁴ Candle ) مي گويند.

2-1-6 : مهمترين گونههاي جنس براسيكا :

مهمترين گونههاي ديپلوئيد رده براسيكا و سردههاي وابسته به آن توسط تجزيه ژنومي مشخص شده و براساس تعداد كروموزومها به شكل زير گروهبندي شدهاند (Mizushima, 1950) :

X = 7: B. adpressa, B. deflexa, D. erucoides

X = 8 : B. nigra, B. fruticulosa, B. mourorum, B. spinenesis

X = 9 : B. oleracea, B. rupestris, B. macrocarpa, B. montana, B. cretica, R. sativus

X = 10 : B. Campestris, B. tournefortii, B. saxatilis, B. repanda, B. barrilirei

X = 11 : B. amplexicauli, B. elongata, B. Sativa

X = 12 : B. hirta

B = Brassica, E = Eruca, D = Diplotaxis, R= Raphanus

سه گونه ديپلوئيد زراعي براسيكا عبارتند از :

• rapa L. (syn, B. Campestris) (Aژنوم, 2n = 2x = 20) شلغم روغني


• nigra L. (B ژنوم, 2n = 2x = 16) خردل سياه


• oleracea L. (C ژنوم, 2n = 2x = 18) كلم

آمفيديپلوئيدي (دو برابر شدن كروموزوم F₁ حاصل از تلاقي دو گونه ديپلوئيد) و انيوپلوئيدي (كم يا اضافه شدن تعداد كروموزومهاي يك فرد)، نقش مهمي در تمايز و تكامل گونههاي براسيكا ايفاء كردهاند و سه آمفيديپلوئيد طبيعي زير از سه گونه فوق منشاء گرفتهاند:

• napus (2n = 4x = 38, AC ژنوم) كلزا


• carinata (2n = 4x = 34, BCژنوم) خردل حبشي


• juncea (2n = 4x = 36, AB ژنوم) خردل هندي

2-1-7 : اهميت اقتصادي و صنعتي کلزا :

روغن و كنجاله دو فرآورده مهم حاصل از دانه كلزا هستند . دانه كلزا حاوي حدوداً 40% روغن است ، روغن کلزا در مقام مقايسه با روغن حاصله از دانههاي روغني ممتاز آفتابگردان ، ذرت و سويا به دليل حضور اسيدهاي چرب اشباع نشده و فقدان کلسترول از کيفيت تغذيهاي بالايي برخوردار است .

در بدو امر ، روغن اين گياه براي صنعت و روشنايي منازل بكار ميرفت ، امروزه در كشورهاي مترقي روغن برخي از ارقام خاص آن به عنوان سوخت موتورهاي ديزل بكار گرفته ميشود و بدليل تحمل حرارت بالا ، در سوخت جت نيز استفاده ميشود ( شهيدي و فروزان ، 1376 ).

گياه كلزا بدليل داشتن اهميت غذايي ويژه در دنياي غرب مورد توجه اصلاحگران قرار گرفته است ، بطوريكه كشورهايي همچون چين ، كانادا ، هند و كشورهاي اروپايي نظير فرانسه ، آلمان و انگلستان در زمينه توليد اين گياه به پيشرفتهاي قابل ملاحظهاي رسيدهاند و در مجموع 4/98 درصد توليد جهاني كلزا را به خود اختصاص دادهاند.

از روغن کلزا در تهيه صابون نيز استفاده مي گردد . انواعي از گونه های کلزا که فاقد اسيد اروسيک هستند برای تهيه مارگارين مصرف مي شوند.

2-2 : اصلاح گياه کلزا :

2-2-1 : روشهای اصلاح کلزا :

مهمترين روشهاي اصلاحي که براي اصلاح کلزا به کار مي روند عبارتند از : انتخاب تودهاي[10]، به نژادي شجرهاي[11] ، گزينش بالک[12] ، تلاقي برگشتي[13] ، انتخاب دورهاي[14] ، اصلاح واريتههاي ساختگي[15] و به کارگيري دورگها[16] . از معايب اين روشها طولاني بودن دورة آنها مي باشد. امروزه متخصصين اصلاح نباتات به دنبال روشهاي ديگري هستند كه بتوانند اين مدت را به حداقل ممكن برسانند تا در وقت و هزينه هاي سنگين برنامه هاي اصلاح نباتات صرفه جويي شود. يكي از اين روشها اصلاح از طريق سيستم دابل هاپلوئيدي مي باشد، كه به عنوان وسيله اي براي تركيب صفات يك تلاقي مي تواند مكمل روش شجره اي باشد. اهميت استفاده از گياهان هاپلوئيد در برنامه هاي اصلاح نباتات از مدتها پيش براي دانشمندان مسلم گرديده است و يكي از موضوعات مهم تحقيقاتي در اين زمينه، توليد لاينهاي هموزيگوس جهت توليد گياهان هيبريد در گونه هاي خودناسازگار مي باشد. با توليد لاينهاي كاملاً هموزيگوت در اين روش 5-3 سال در زمان برنامه هاي اصلاحي صرفه جويي مي شود. سيستم دابل هاپلوئيدي در صورتي موفق است که به توان گياهان هاپلوئيد و دابل هاپلوئيد توليد کرد ، بدين منظور قبل از استفاده از اين سيستم آزمايشاتي را در جهت بهينه سازي گياهان مي بايست انجام داد.

2-2-2 : اهداف اصلاحي کلزا :

از مهمترين اهداف اصلاحي کلزا،اصلاح برای کميت و کيفيت روغن می باشد(Sauer and Kramer, 1983 ) . نکتهاي که بايد در مورد روغن به آن توجه کرد ، نوع مصرف روغن ميباشد(عزيزي و همکاران، 1378 ). بطوريکه اگر هدف توليد روغن خوراکي باشد ارقام با اروسيک اسيد پايين، مناسب ميباشند. اين ارقام ( بدون اروسيک اسيد يا با اروسيک اسيد پايين ) به طور طبيعي داراي 80 - 60 درصد اولئيک اسيد ،30 - 10 درصد اسيدهاي چرب داراي حلقههاي غيراشباع و تنها 10 – 5 درصد اسيدهاي چرب اشباع شده ميباشند. در اين زمينه با وجود دسترسي به ژنهاي کلون شده رمزکننده اولئات مي توان از روش آنتي سنس استفاده کرد تا ميزان اسيدهاي چرب اشباع نشده روغن کلزا را کم کرده يا از بين ببرد. در توليد روغنهاي صنعتي ، هدف اصلاحگر ، توليد ارقام کلزا با اروسيک اسيد بالا ميباشد . در کلزا مقدار اروسيک اسيد توسط دو مکان ژني کنترل ميشود(Kirk and Hurlestone., 2004 ). مقدار روغن تحت تاثير عوامل محيطي ( بالاخص درجه حرارت و تنش رطوبتي ) و عوامل ژنتيکي ميباشد (Grami et al., 1977 ). از اهداف اصلاحی ديگر مي توان به اصلاح برای بهبود کيفيت کنجاله و مقاومت به بيماريها و آفات اشاره نمود. کاهش گلوکزينولات و افزايش پروتئين از عوامل مهم در بهبود کيفيت کنجاله کلزا هستند . چندين ژن سطح گلوکزينولات را در کلزا تعيين ميکنند (Demarch et al., 1989 ). در کنجاله دانه هاي روغني خانواده كلزا ( Brassica)25 - 20 درصد پروتئين با کيفيت تغذيهاي بالا وجود دارد . کنجاله کلزا از نظر اسيدهاي آمينه ضروري مانند ليزين و متيونين فقير ميباشد. تلاشهايي صورت گرفته است تا ژنهاي کدکننده پروتئينهاي ذخيره اي غني از متيونين را از گونه هايي نظير بادام برزيلي و Bertholletia excelsa به کلزا منتقل نمايند ( عزيزي و همکاران، 1378 ) .

2-3 : گياهان هاپلوئيد :

در گياهان به هنگام توليد مثل جنسي ، در اثر تقسيم ميوز تعداد كروموزومها نصف مي شوند و در نتيجه سلولهايي با تعداد كروموزومهاي كاهش يافته به وجود مي آيد . اگر چنين سلولهايي بدون انجام عمل لقاح به يك گياه تبديل شوند، به آن گياه هاپلوئيد مي گويند كه سلولهاي آنها حاوي n كروموزوم خواهد بود) Pierik., 2004 ) . مدتهاي طولاني است كه مفهوم هاپلوئيد در زمينه هاي ژنتيك و به نژادي مورد توجه مي باشد ولي بهره برداري از آنها محدود باقي مانده است . زيرا اين پديده در طبيعت با فراواني بسيار كمي اتفاق مي افتد ( باقري ، 1379 ) . اهميت استفاده از گياهان هاپلوئيد در برنامه هاي اصلاح نباتات از مدتها پيش براي دانشمندان مسلم گرديده است و يكي از موضوعات مهم تحقيقاتي در اين زمينه توليد لاينهاي هموزيگوس جهت توليد گياهان هيبريد در گونه هاي خودناسازگار مي باشد ( نوري قنبلاني ، 1371 ) . هاپلوئيدها در بسياري از تيره ها و جنس هاي گياهان بازدانه و نهاندانه تشكيل مي شوند ( Palmer et al., 1996 ) .در طبيعت هاپلوئيدهايي كه از سلولهاي جنسي مادري به دست مي آيند فراوانتر از هاپلوئيدهاي حاصل از سلولهاي جنسي پدري مي باشند ( Foroughi et al., 1990 ) .

2-3-1 : مزايا و کاربردهاي هاپلوئيدها :

گياهان هاپلوئيد در اصلاح نباتات ژنتيك و مهندسي ژنتيك[17] داراي كاربرد فراواني هستند كه برخي از آنها عبارتند از :

1- در نتيجه القاي هاپلوئيدي و به دنبال آن دو برابر شدن تعداد کروموزومهاي هاپلوئيد توليد شده، امکان رسيدن سريع به هموزيگوسيتي وجود دارد و در نتيجه تحقيقات ژنتيکي و اصلاحي را آسانتر ميکند. در شرايط هموزيگوسيتي تفکيک ژنتيکي ساده است و آللهاي مغلوب توسط آلهاي غالب پوشيده نخواهند شد. براي اصلاح کننده اي که با گياهان دو پايه و خود ناسازگار سر و کار دارد، توليد گياه هموزيگوس بسيار مهم است. گرچه در گياهان خودگشن از طريق خودگشني ميتوان به هموزيگوسيتي مناسبي دست يافت، ولي براي رسيدن به هموزيگوسيتي کامل به 5 تا 10 نسل خودگشني نياز است. در واقع يکي از مزاياي هاپلوئيدي و توليد دابل هاپلوئيد ، توليد لاينهاي خالص ميباشد که در مورد گياهان داراي دگرگشني، نيز امکان پذير ميباشد ( Kasha, 2003 ) .

2- درجمعیت گیاهان هاپلوئیدوجود تفرق ژنتيكي و نسبتهاي ژنتيكي سادهتر در گياهان هاپلوئيد و در نتيجه به جمعيتهاي كوچكي جهت مطالعات ژنتيكي ( Mohan Jain et al., 2003 ) .

3- از گياهان هاپلوئيد میتوان در مطالعات موتاسيون استفاده کرد ( Mohan Jain et al., 2003 ) .

4- بدليل پايداري ژنتيكي رويانهاي آندروژنيك[18] و مريستمهاي انتهايي هاپلوئيد ميتوان اقدام به نگهداري اين مواد و تأسيس بانك ژرم پلاسم[19] نمود ( Mohan Jain et al., 2003; Kumar, 1995 ) .

5- از هاپلوئيدها در مطالعات سيتوژنتيك براي توليد و دستيابي به مونوسوميها[20]، ناليسوميها و آنيوپلوئيدها استفاده میشود ) Pierik., 2004 ) .

6- از هاپلوئيدهاي مضاعف شده دربرنامه های اصلاحی به منظور شناسايي تركيبات هيبريد برترمی توان . .(Pickering and Devaux , 1992 ) استفاده کرد

7- انتقال ژن پلي پلوئيدها[21] به يك گونه خويشاوند با استفاده از هاپلوئيدهاي يك گونه پلي پلوئيدامکان پذیرست ( Kasha , 2002 ) .

8- استفاده از هاپلوئيدها در بررسي پلي مورفيسم و ايجاد نقشه هاي ژنتيكي بر اساس RFLPs در گونه هاي مختلف گياهي ( Moha Jain et al.,2003 ).

9- برطرف شدن محدوديت تهيه لاين خالص در گياهان دو پايه و خودناسازگار ( Kumar, 1995 ).

10- استفاده از هاپلو ئيدهاي دوبل شده جهت محاسبه مقادير نو تركيبي بين ژنهاي پيوسته . ( Pickering and Devaux , 1992 )

11- براي انجام امتزاج سوماتيکي ، کار کردن با پروتوپلاستهاي هاپلوئيد بسيار راحت تر از کار کردن با پروتوپلاستهاي ديپلوئيد است ( Kasha ., 2002 ) .

2-3-2 : مشكلات و محدوديتهاي هاپلوئيدها :

در زمينه توليد گياهان هاپلوئيد در شرايط درون شيشهاي ، مشكلات و محدوديتهايي نيز وجود دارد كه برخي از آنها عبارتند از :

1) عدم باززايي يا باززايي اندك رويانهای هاپلوئيدی ( Bruins and Snijder, 1995 ).

2) مزيت توليد هاپلوئيدهاي مضاعف از كشت بساك تنها به ژنوتيپهايي كه پاسخ مطلوب از خود نشان
ميدهند ، محدود ميشود ( Bohanic et al., 1993 ) .

3) تشكيل كالوس به صورت خودبهخودي يا القاء آن توسط مواد تنظيمكننده رشد، در محيط باززايي ، يك عامل محدود كننده ديگر در استفاده از رويانهای هاپلوئيد ميباشد ( باقري ، 1376 ) .

4) بوجود آمدن گياهان آلبينو[22] حتي وقتي كه فراواني القاي رويان و باززايي گياه بالا باشد

( Zhau and Konzak, 2005) .

5) وجود تنوعات گامتوكلونال[23] و سوماكلونال در نتاج حاصل از كشت بساك تا حدودي از خاصيت توليد لاينهاي يكنواخت ميكاهد ( Mohan Jain et al., 2003) .

6) تشكيل رويانهای ثانوي بر روی رويانهای هاپلوئيد.

2-3-3 : روشهاي توليد گياهان هاپلوئيد :

2-3-3-1: توليد خود به خودي[24] :

از روشهاي توليد خود به خودي گياهان هاپلوئيد مي توان به موارد زير اشاره كرد :

Mohan Jain et al., 2003) )

1- پارتنوژنز[25] ( توليد رويان از يك تخمك بدون دخالت گامت نر )

2- آپوگامي[26] ( تكامل رويان حاصل از يك سلول گامتو فيت )

3- سمي گامي[27] ( تقسيم مستقل هسته سلول تخم و سلول زايشي دانه گرده كه منجر به توليد يك گياه هاپلوئيد شمير مي شود )

4- پسودوگامي[28] ( نمو رويان بعد از گرده افشاني و بدون دخالت گامت نر)

در سمی گامی باروری کامل نیست وبینSyngamy(اتحاد گامتهای نر وماده)وپسودگامی قرار می گیرد. هسته گامت نر معمولاً وارد هسته تخم ميشود و سپس شروع به تقسيم همزمان ميكند .رويان نمو یافته ، اغلب تب